洁净室质量控制及其检测方面的讨论

洁净室质量控制及其检测方面的讨论

洁净室对于制药工业的重要意义已为人们肯定。生物制品 是制 药工业的一部分，对生产厂房有很高的洁净要求^［1，2］。Gilland等曾在市售的 嗜酸乳杆菌产品中，分离到人为污染的短乳杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌等^［3］ 。生物制品生产中，尤其是活菌、活疫苗的生产中，经常受到不同程度的污染，因此，不仅 需要重视洁净室的建立，更要重视质量控制方法及标准。

　　朝鲜战争中，美国发现大量电子仪器失灵，zui后找到了主要原因，是灰尘在作怪，促成了洁 净技术的起步。1961年，诞生了世界上zui早的洁净室标准，既美国*技术条令203，1963 年，颁布了上zui的洁净室标准：美国联邦FS209。1966年，颁布了修订后的209A， 时至1992年，建立了迄今被广泛采用的209E。上为了加强药品、生物制品质量管理规范 （GMP），把洁净室定为*的生产硬件之一。GMP对厂房、设备等，明确规定了相应的洁净要 求，并制订了有关标准。

　　1　洁净室的污染源

　　洁净室污染源按性质可分物理、化学、生物等。直径在0.001-1000μm的固态、液态或二者 的混合物质，包括生物粒子和非生物粒子，我们称为悬浮粒子（airborne particles）。微生 物一般以无生命的粒子作载体而悬浮，以气溶胶（Aerosol）形式存在于空气中，1μm以下 者永外悬浮，10μm以上者会逐渐沉下来而形成菌尘。洁净室污染可分为外部污染和内部污 染。外部污染指大气尘污染，可以通过光电法测得。内部污染，是由人和有关的物品、设备 等引起的。人是洁净室zui大的污染源，占90%左右。人和环境造成了洁净室的污染，所以在 洁净室中，人的数量和活动应有特别严格的限制。一般男性每人每分钟向周围排放1000个以 上的含菌粒子，女性为750个以上。穿衣服时，静止态发菌量为10-300个/min·人，行走时 的发菌量为900-2500个/min·人。咳嗽一次发菌量为70-700个/min·人，喷嚏一次为400-60 0个/min·人^［4，5］。

　　2　洁净室质控标准

表1　世界主要国家洁净室标准（洁净度级别）

　　 洁净室是指空气洁净度达到规定级别要求的可供人类工作的场所 ，其功能是控制微粒的污染 。一般按用途可分为：1.工业洁净室，以无生命的微粒为控制对象；2.生物洁净室，主要 控制微生物对工作对象的污染。

　　世界主要国家的洁净室标准见表1^［6，7］。美国是世界上zui早颁布洁净室标准的 国家，各国的洁净室标准都是在美国标准的基础上，结合各国的实际情况而制订的，我国的 标准基本上参照美国联邦标准和欧共体的标准而制订的。

　　3　洁净室质控的检测方法及讨论^［8］

　　3.1　尘埃粒子　由于空气中存在大量尘埃粒子，而微生物大多依附于这些尘埃粒子随空气流动造成污染。制 药工业用多种方法获得无菌状态，过滤法以其捕集率高，又经济而被广泛使用。其中，特别 应该提到的是采用了HEPA（High Eicienoy Particulate Air）过滤器，对0.3μm以上空气 粒子捕集率高达99.97%以上，除滤过病毒外，空气中所有微生物颗粒可被滤除。因此， 正常洁净室是无菌的，但是，由于人、物、环境等污染因素，洁净室往往受到不同程度 污染。因此，我们多采用激光尘埃粒子计数且进行监控。标准见表2。

表2　国内外有关悬浮粒子的测定标准（尘粒数/m³）

　　3.2　空气微生物　空气中活微生物大多依附尘埃粒子而形成生物活性粒子。应用细菌采样器抽取一定量的空气 使其滞留在培养基上，经过培养计数菌落数。早在现代微生物问世之前，人们就认为某些疾 病是由被称为“瘴气”的空气污染而引起。20世纪30年代，英国研制porton液体采样器，美 国研制了AGI液体采样器。1941年，Bourdion使用裂缝式采样器，成为空气微生物采样测定 的开端。1956年，报道了*个筛孔撞击式采样器，1958年A.A.Andersn对其加以改进并 定型生产，称为安德森（Anderson）空气微生物采样器。它由顶罩、6节筛板、3个弹簧及抽气 孔和动力装置构成。目前，这种采样器已发展到8级，并有许多改进型。由于它采集粒谱广 、效率高、生物失活率低等原因而广泛使用至今。空气微生物采样器一般分为七大类：液体 式、固体式、沉降式、离心式、光散射式和大容量式。本文将对离心式空气微生物采样器（R CS）作详细讨论。空气微生物测试标准见表3。

表3　国内外有关空气微生物的测定标准（CFU/m³）

　　 3.3　表面微生物　为了检测洁净室中墙壁、地板、仪器表面、桌 面、门把等带菌情况，通常选用接触压印法（Cortact）和棉拭法（Swabbing）等方法。需要时 ，还可与过滤装置相结合来完成棉拭采样。1941年，Walter和Hvcker报道了COntact琼脂平 板方法，以后，Angelotti和Fotert等作了进一步的工作。带菌状况都有要求，欧共体GMP（ 草案）规定，100级：平均菌落数不可超过5 个；1000级：25个；100000级：50个。表面微生物的检测，越来越受到人们的重视。

　　3.4　关于沉降平皿（Settle plate）　1881年Kock创立。依靠空气中的粒子自然沉降于琼脂平板上的这种采集方法，由于粒子沉降 的速率很慢，如需采集到有效数量的粒子，就需暴露很长时间。但因空气中的致病菌数量是 很少的，金黄色菌菌球菌在医院病房空气中平均每140升才有一个活菌粒子，为了弥补这个 缺陷，曾采用直径为14公分的大平皿，以增加琼脂的暴露面积。Harding和Williams还曾用 一种多层平板的方法来进一步暴露面积，每层放一个14公分直径的平板，但结果不堪满意。

　　奥姆梁斯基曾试图把采样后平板上长出的菌落换算成一定体积空气中的微生物含量，以便能 利用沉降平板法的采样结果来测定空气中的活菌浓度。为此，他设定了在100cm²营养琼脂 上暴露5分钟后，培养长出的菌落，即相当于10升空气中的活菌数。由于悬浮在空气中的含 菌粒子直径不超过100μm，这些小粒子在空气中的沉降受空气阻力的影响，其沉降速率遵循 上的Stokes公式。根据这个公式，粒子的沉降速率与其大小成正比，但是，奥姆梁斯基 恰好忽略了这一点，因此，它是不能成立的。例如，直径1μm的含菌粒子，在5分钟内沉降 距离为1.05cm，大部分的粒子就沉降不到琼脂表面上。

　　由于洁净室已滤除了大部分大颗粒，一般用此法是无意义的。但是，人为、环境和洁净装置 故障等原因引起的较大颗粒污染以及沉降平板采样洁的简便，可作为日常监测洁净室水平的 一种参考方法。

　　3.5　关于RCS^［9］　离心式空气采样器（The Reuter Centrifugal Sampler,RCS）被介绍作为一种在医院使用的检 测空气微生物的仪器，由于它轻便，无噪音而广泛使用，并扩展到制药工业等领域。RCS通 过离心收集颗粒，为制药工业所接受，因为它似乎符合FDA所描述的“Active”采样仪器。 。Gre-schel等认为它相当有效，Macher等则持反对意见。多年来，许多研究者研究了带菌 颗粒的大小，结论是：5-15μm，中等粒是13μm，而4μm以下很少。这些结果是从医院、手 术室、办公室、实验室和制药无菌室所获得。他们认为，如果颗粒大小是已知的，RCS可定 量测定细菌浓度，但是，目前这些颗粒大小是未知的，故不能把它视为定量采样器，只能归 于沉降平皿一样的类型。Delmore等发现，100级无菌室中，RCS/slit比率是2.1，即RCS是s lit采样器微生物捕促率的210%有效。我国丁玺华等也仿制了RCS，选用国产元件，试制了LW C-1型离心式空气采样器。

　　虽然RCS有正反两方面的争议，但由于它有许多优点，并明显优于沉降平皿，1986年，西方 近一半的制药公司采用了RCS，作为空气微生物采样器，我国正在逐渐推广。